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葡聚糖凝胶是一种珠状的凝胶，含有大量的羟基，很容易在水中和电解质溶液中溶胀。亲水基质使其非特异性吸附最小化，并在生物分子分离期间得到较高的回收率。G型的葡聚糖凝胶有各种不同的交联度，因此它们的溶胀度和分级分离范围也有所不同。葡聚糖凝胶的溶胀度基本上不因盐和洗涤剂的存在而受影响。

葡聚糖凝胶有不同的粒度。超细级的葡聚糖凝胶是用于需要极高分辨率的柱色谱和薄层色谱。粗级和中级的凝胶用于制备性色谱过程，可在较低的压力下获得较高的流速。另外，粗级也可用于批量工艺。

凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。

小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗，入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。这样被分离物质即被按分子的大小分开。

• 上样之前，样品必须经过膜过滤及去除色素，否则杂质及色素会被吸附到填料上，影响填料的正常使用。所有的缓冲液均需要用0.45μm的过滤器过滤。
  
• 在使用过程中，避免使用高浓度的强酸强碱，酸和碱的浓度应低于0.1摩尔。碱会使流速变慢。
  
• 不同的样品，洗脱方法不相同，可以根据相关的文献进行。如果分离效果没有达到预期，请自行摸索增加柱子高度。

• 填料的准备：
  
  • 将填料在过量去离子水或缓冲液中（水∶填料＝1∶20倍以上，即1g填料加入20mL水，水过量才能充分溶胀），室温条件下膨胀48小时，或用热水膨胀1～3小时（沸水与凝胶混合后自然冷却，无需持续加热，不要水浴！）。洗脱缓冲液不应含有高粘度的试剂。溶胀完毕后，如果上层有少量漂浮物，请去除。
    
  • 将溶胀好的填料，所有的缓冲液等材料平衡至实验操作温度，对所有的缓冲液进行抽滤和脱气处理。填料本身不需要脱气，不要带填料一起超声。
• 装柱：
  
  • 检查层析柱所有部件，特别是过滤网，密封圈，螺旋塞是否紧密，玻璃管是否干净和完整。
    
  • 将柱内及柱子底端用水或缓冲液润湿并保持一小段液位，务必使底端无气泡。
    
  • 用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内，注意勿使产生气泡。打开柱子出液口，使凝胶在柱内自由沉降，连结好柱子顶端柱头。
    
  • 打开蠕动泵（必须恒流恒压），让缓冲液用使用时流速的1.33倍的流速流过，使柱床稳定（注意压力不要超过填料最大耐压）。使用过程中流速建议设置成为重力自然流速，即未连接蠕动泵，下端打开出液口，使流动相随重力下降的速度。
  • 装柱是凝胶层析中一个关键的操作步骤。灌注凝胶时要求将均匀的凝胶一直加到所需柱床高度，不能时断时续，否则将出现分层或“纹路”等现象。若在灌好胶后才发现“纹路”、分层等现象时，要重新装柱，以免影响层析效果。
    
  • 在做大型的凝胶柱时，灌注的凝胶是否均匀往往从表面上看不出来。所以使用前应该用一些带色的大分子物质如细胞色素C、血红蛋白或专用的蓝色葡聚糖-2000(Blue dextran-2000)通过凝胶柱，观察形成的色斑带是否整齐，若斑带歪斜，应该重新装柱，直至达到要求。
• 平衡：上样前平衡层析柱至少5～10个柱体积直到填料液面本身不下降，记录仪基线变得平稳为止。
  
  • 流出液的pH值和电导值等于上柱的Buffer的pH值和电导值。
• 上样：样品一定要离心或过滤后（0.45μm滤膜）上样。如果有不溶物会堵塞凝胶。凝胶过滤的上样量一般为不大于5%的柱床体积（即100mL的柱体积上样量不要大于5mL，浓度自定，但是样品一定要完全溶解，如果是多糖类粘度高应进行稀释。），我们建议初次上样控制在1～2%的柱床体积，视分离情况可以调整；脱盐时上样量可以达到20%的柱床体积，柱高的选择也与分离要求相关，柱子越高，分离效果相应越好，但是，柱高过高的凝胶柱会引较大的反压，也应当尽可能避免。难分离物质要有一定柱高和流速控制，脱盐时高径比为5∶1即可。
  
• 洗脱方法：
  可以用无盐水，也可以采用上柱时的缓冲液洗脱。
  
  • 洗脱缓冲液不固定，有特殊需求请参考相关文献，最基础的为纯水。
  流速：接蠕动泵情况：未接泵之前上端不封闭，下端出液口打开，记录流速，蠕动泵流速按照自然流速设置；
  如果不接蠕动泵：按照可以参考右侧图中设置。静水压越大，洗脱液的流速就越快。这个压力差可以调动，如提高洗脱瓶的位置或瓶中液面的增减，压力需要根据柱子高度和直径自行调整。
  
• 在位清洗（CIP）：
  凝胶使用十次后作一次CIP，目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。方法是用0.1M氢氧化钠洗2个柱体积，再以至少10个柱体积平衡缓冲液再生。多次使用凝胶颗粒将逐渐沉积压紧，流速将减慢，所以使用一段时间后应倒出来，清洗后重新装柱。再生清洗可以在柱子中进行，也可以卸下来再生，如果是在柱子中进行，流速可能会变慢，如果流速变慢建议重新装柱，酸碱浓度不要高于0.1M，并且时间不要过长，否则会损坏填料。

未处理的填料，室温密闭保存。使用完的填料，用纯水将盐分彻底冲洗，最后保存在20%乙醇中，4℃保存。实验间隔时间短，第二天继续使用，可以直接保存在流动相中。如有遇到长菌情况，建议不要继续使用。

• 溶胀倍数有批次间差异，数据仅供参考。